使用Image J进行自动荧光定量分析

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在这里我整理我最近使用 ImageJ 软件自动数细胞以及定量分析荧光强度的步骤。

ImageJ 的主面板:

0402337igryryhr2y8ryy9.jpg

打开文件

File → Open →’.zvi’

先把 2D 的所有图叠加起来,选项选 max intensity

Image → stacks → 3D project

0402337igryryhr2y8ryy9.jpg

复制一张图:

Image → duplicate

调整 Thereshold,实际上是选择想要纳入计算的细胞的区域,选定的区域会用红色高亮标记:

Image → Adjust → Threshold

0402337igryryhr2y8ryy9.jpg

如果觉得背景太强可减去背景:

Process → Subtractbackground

当红色高亮标的斑块就是想要的细胞时,点击 Apply

Image → Adjust → Threshold→ apply

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有些细胞叠加,可用 watershed 自动划为两块斑块。

Process → Binary → watershed

设定参数,在这里 redirected to...不能选择已经标记的这张图,实际上这张已经被转换为二进制图,只有黑和白二色,要选择 adjust thereshold 之前的那张,这就是为什么 3D Z-stack 之后要多复制出一张图。

Analyze→ Set measurements (Redirected to… greyscale image)

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然后点击

Analyze → Analyze particles

0402337igryryhr2y8ryy9.jpg

我的细胞大小大概是

size 是 250-infinity.因为我只感兴趣荧光平均值,如果要定量细胞大小,可能要选 250-350,否则

有些叠在一起的细胞会被当做一个细胞来计算

Size(pixel^2)=250

Soma size=5 m ^2

5 μ m=31.25 pixel

5 m ^2=244pixle^2≈250pixel^2

show 里面选择 outline 也很好,可以自动圈出细胞

Show: outlines→ OK

0402337igryryhr2y8ryy9.jpg

过几秒钟,这个图就出来了同时还有 result 和 summary,是 Excel 表格,可以保存。

然后就可以得到图片中细胞数量,荧光强度平均值,最大最小值等等数据。看这张圈圈图,还是很帅的,呵呵。这些步骤还是很烦的,小水獭刚弄的时候几次想放弃,步骤太多,前后次序不能乱,小水獭表示为什么不能更加简便一些,不就是画圈圈么,汗//b 不过处理了 50 张图以后,小水獭表示短期内还是能记住这些步骤的,于是在博客里保留一个中文使用说明,以助他日之用。

主要参考的是第一篇文献(我会告诉你我基本是翻译第一篇文献么,╭(╯ ^╰)╮哼~~~),第二篇给了很好的调整的提示。

等我写完了之后,我想,以前别人也肯定会遇到同样问题啊?!然后 google 了一下(Image J 荧光),科学网,小木虫都有的:

早知道就 google 中文的了,google(Image J, fluorescence quantification)只找到英文步骤,其实挺难搞懂的。

参考文献:

http://www.unige.ch/medecine/bioimaging/tricks/imagejtutorials/Quantification.pdf

http://sciencetechblog.com/2011/05/24/measuring-cell-fluorescence-using-imagej/

说你懂得生之微末,我便做了这壮大与你看,你说再热闹也终需离散,我便做了这一辈子与你看,你说冷暖自知,我便做了这冬花夏雪与你看,你说恋恋旧日好时光,我便做了这描金绣凤的浮世绘与你看。你说应愁高处不胜寒,我便拱手河山,讨你欢。